11.2.3.1 长醇激酶
在T.reesei QM9414的质膜组分中发现了长醇激酶（DolK），该酶催化γ-磷酸基团从CTP转移到长醇分子上（Kruszewska et al.，1994）。在S.cerevisiae中，发现DolK在可利用的脂类媒介物调控方面起主要作用（Heller et al.，1992），由此调节糖基化的效率。与DPM合成酶不同的是，T.reesei QM9414的DolK活性不受培养基中葡萄糖的影响，提高培养温度（35℃），菌丝中的DolK活性大幅度提高，其他参与蛋白质O-甘露糖基化的酶活性也同样大幅度上升，但对DPM合成酶和蛋白质甘露糖基转移酶来说，其活性的提高只有在外源长醇磷酸酯缺乏时才明显（表11.3），表明在高温培养时，菌丝细胞质膜中的长醇含量和长醇磷酸酯含量都增加。从35℃培养的T.reesei中提取的总脂能够提高DolK活性（DolK提取自25℃培养的T.reesei）进一步证明了以上现象的存在。可见，温度能够影响细胞质膜中的长醇含量。
表11.3 温度对参与T.reesei QM9414蛋白质O-甘露糖基化反应的各种酶活性的影响
注：酶活性表示为5min内膜蛋白形成的产物量（pmole/mg）。
缩写：DPM为甘露糖基磷酸长醇酯（Mannosylphosphodolichol）；Dol为长醇；DolP为长醇磷酸酯。
11.2.3.2 DPM 合成酶
Kruszewska等（1990）发现T.reesei QM9414胞外蛋白质的分泌可被胆碱和吐温80促进，这种促进作用与DPM合成酶活性的大幅度提高有关。当真菌培养在碳源分解产物解阻遏型培养基上时，这种效应就更加明显，例如用乳糖替代葡萄糖作为碳源。有趣的是，当胆碱或者吐温80存在时，菌株RUT C-30的DPM合成酶活性下降，但其蛋白分泌不受影响；同时，体外测定时胆碱或者吐温80 对 DPM 合成酶的影响消失。还观察到只有DPM合成酶的活性发生了显著变化，而其他位于内质网上的糖基化酶活性没有受到影响。与酵母和动物细胞中的类似酶一样，木霉的DPM合成酶活性在体外试验时也为磷脂酰胆碱（PC）所促进。由此推测，DPM合成酶活性的增加是由内质网膜中磷脂酰胆碱的富集所引起的。但从另一方面来看，T.reesei QM9414和RUT C-30胞内质膜中的PC浓度并未发现显著差异。
根据胆碱和吐温80对蛋白质分泌及DPM合成酶活性的影响情况，有人提出DPM合成酶活性可能是T.reesei蛋白质分泌的限速节点（Kruszewska et al.，1989，1990）。为了寻找这种看法的分子证据，构建了 T.reesei的一个重组菌株，该重组菌株含有来自S.cerevisiae的dpm1基因（编码DPM合成酶），基因置于T.reesei的组成型启动子下。与亲本菌株相比，重组菌株的DPM合成酶活性有一定程度的增加，纤维素酶分泌量大约增加了10倍，CBHI量增加了6倍（Kruszewska et al.，1997）。将重组基因置于木霉的强启动子之下是广泛应用的技术，利用该技术进一步研究了蛋白质分泌的促进效应，发现S.cerevisiae的DPM至少在细胞的3个生化步骤上起重要作用（Orlean，1990）：①提供甘露糖残基供体，在N-糖苷键合成过程中以供连接在长醇磷酸酯上的寡糖链延长；②提供第一个O-糖苷键连接的甘露糖残基；③合成磷脂酰肌醇（PI）锚定物的糖基团，该锚定物在质膜上锚定一些蛋白质。
11.2.3.3 GTP：a-D-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶
除了作为脂-聚糖媒介外（例如DolPP-GlcNAc2Man9 Glc3），GDP-甘露糖也是N-和O-连接的聚糖合成中甘露糖的供体。现在已知第一组5个甘露糖残基直接从GDP-Man加在长醇连接的二寡糖上（DolPPGlcNAc2），反应发生的位置在内质网的溶质区域，而随后的4个甘露糖残基则来自内质网腔区域的 DPM（Abeijon et al.，1992；Herscovics et al.，1993；Tanner et al.，1987）。在高等真核生物细胞中（例如视网膜和甲状腺组织细胞），GDPMan不仅仅是甘露糖基转移酶的底物，也间接促进非甘露糖GlcNac-脂类的生物合成（Kean，1980；Ronin et al.，1981）。Kruszewska等（1990）曾经报道了T.reesei 中GDP-Man对蛋白质O-糖基化的间接促进作用，并自T.reesei分离到了编码鸟苷酰转移酶的一个cDNA片段。核苷酸序列分析表明，该克隆有一个1.6 kb的开放阅读框，推定的编码蛋白包含354个氨基酸，两者与S.cerevisiae鸟苷酰基转移酶编码基因（mpg1）及其蛋白的同源性分别为81%和71%（Kruszewska et al.，1998）。Zakrzewska等（2003）将来自T.reesei的编码 GTP和长醇基磷酸甘露糖合酶（DPMS）的基因 mpg1和dpm1 分别在T.reesei中过表达，结果发现在 dpm1 过表达的转化子中 DPMS 活性没有明显提高，而mpg1过表达的转化子中GDP-甘露糖（GDPMan）的水平提高了2倍。甘露糖基转移酶以甘露糖为底物，导致糖基化的分泌蛋白高度甘露糖基化。Mpg1过表达提高了dpm1的转录水平和DPMS活性，这说明细胞内甘露糖水平在T.reesei分泌蛋白的糖基化过程中有重要作用。
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